一、靶向组织与时相取样
根据研究内容一的结果，选取几个睡眠调控关键脑区（如SCN、VLPO、下丘脑外侧区、海马等）以及脑脊液样本。在正常昼夜周期和节律紊乱条件下，不同时相（主观日间、夜间，睡眠和觉醒状态）的动物上获取组织和体液样本，以捕获动态变化信息。特别关注睡眠期间和清醒期间的差异，以及节律紊乱导致的异常模式。
二、转录组和表观组学
应用RNA测序（RNA-seq）技术分析上述脑区在不同条件下的基因表达谱变化。重点关注生物节律基因（如Clock/Bmal1调控的下游基因）、睡眠相关基因（如编码神经递质受体、离子通道等）以及代谢与炎症通路基因的差异表达。结合表观遗传组学（如DNA甲基化测序、组蛋白修饰ChIP-seq），探究节律紊乱是否通过表观调控机制影响基因表达节律性。预期可鉴定数十个在睡眠障碍模型中显著失调的候选基因，为深入研究提供线索。
三、蛋白质组和代谢组学
采用高分辨率质谱技术分析相应脑区的蛋白质表达和修饰变化，以及脑脊液中的代谢产物谱。特别关注与睡眠-清除功能相关的蛋白（如AQP4、水通道蛋白、突触可塑性相关受体、炎症因子等）和代谢废物（如乳酸、β-淀粉样蛋白片段等）的水平变化。利用标记定量（TMT或iTRAQ）提高定量精度，比较模型与对照的差异。结合代谢组数据，揭示睡眠过程中能量代谢、神经递质代谢和代谢废物清除通路的紊乱情况。
四、关键分子鉴定
综合多组学结果，筛选出在睡眠障碍模型中反复出现异常的关键调控分子23个。例如可能发现某炎症介质和某激素通路分子始终上调，提示其可能介导睡眠质量下降。针对这些分子，可通过文献调研和数据库分析了解其功能，并设计后续验证实验（如基因敲除或药物拮抗）评估其因果作用。此外，从脑脊液代谢产物中筛查潜在诊断标志物12种，要求其在节律紊乱模型中呈现显著、可检测的变化，未来可望通过无创手段在临床上加以检测，用于睡眠障碍诊断或风险预测。
五、多模态数据整合与语义分析
面对海量组学数据，我们将引入人工智能辅助进行整合分析。利用申请人团队开发的语义编程方法，构建睡眠调控相关的知识图谱，将转录组、蛋白质组、代谢组发现的各分子及通路以语义网络表示，关联到已有生物学知识（如Gene Ontology、KEGG通路）。通过人工意识OS，在DIKWP框架下对数据进行分层处理：数据层进行标准化处理，信息层进行统计分析和模式提取（如共表达网络、分子模块识别），知识层引入文献证据和生物通路知识以解释这些模式，智慧层通过推理找出最可能的调控核心分子，目的层最终形成对研究问题的回答（如确定最关键的病理环路及分子）。整个过程通过语义指令控制，研究人员以接近自然语言的方式询问系统（例如“找出引起睡眠质量下降的上游调控因子”），系统经由人工意识模型综合多方面信息给出答案或假说。这将极大提高多组学数据到生物学知识的转化效率。
六、验证实验
针对鉴定的关键分子和标志物，开展定向验证。例如，通过免疫组织化学在模型脑组织验证关键蛋白的表达变化；应用脑立体定位注射特异性受体激动剂/拮抗剂到靶向脑区，观察对睡眠行为的影响；对于标志物，设计ELISA检测评估其在更多模型个体或预实验临床受试者中的水平差异，以确认其诊断价值。
七、预期结果
识别出2~3个在节律失调性睡眠障碍中起关键作用的调控分子及通路，阐明它们影响睡眠和代谢清除的作用机制。这些分子将成为潜在的干预靶点。同时，筛选出1~2种可用于疾病早期诊断或疗效监测的体液标志物。构建包含多层信息的睡眠调控分子网络模型，加深对睡眠分子调控机制的系统认识。借助人工意识框架的语义分析，实现多组学数据的高效整合，这本身也是一项创新性方法学成果。